前沿技术- 单细胞测序技术小讲

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引言单细胞测序技术是21世纪生命科学领域的前沿技术，自诞生之日起就给科学的发展提供了很多新的发现，更是连续数年被Nature等顶级期刊评为“年度技术”。作为单细胞领域的技术从业者，

一、单细胞测序技术为什么如此火热

细胞是生物体和生物过程的运作基础，在类型、行为和状态上有着广泛的差异（即细胞异质性）。传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则比较低。同时如果目标细胞占比本来稀少，则这些细胞的信息会被平均或覆盖掉。

单细胞测序技术很好的解决了bulk RNA-seq的问题，可以对单个细胞内的核酸（DNA或者RNA）进行捕获建库，因而获得单个细胞中的信息。单细胞分析（scRNA-seq）可以反映群体内细胞间的异质性和小群体细胞的重要功能，特别是细胞之间的细微差异也可以解析出。因此单细胞测序技术又被称为“分子显微镜”。

单细胞测序技术最早兴起于2009年，由北京大学汤富酬教授提出并发表了第一篇单细胞文章。随后十几年以来持续不断地发展，尤其是近几年，单细胞测序出现了爆发式的发展和普及。2011年，《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。2013年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《Nature Methods》杂志将单细胞测序的应用列为2013年年度最重要的方法学进展。2017年10月16日，与 “人类基因组计划” 相媲美的 “人类细胞图谱计划” 首批拟资助的38个项目正式公布，引爆单细胞测序新时代。

二、单细胞测序技术原理

目前有两种方式可以实现单细胞测序。一种是通过显微方式直接获得单个细胞，并将其内部的核酸物质获取出来进行文库构建。代表性的技术有smart-seq2，采用流式方法进行单细胞的分离获取。不过将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。

另一种方式是引入分子标签（barcode）技术，在单细胞分离的同时给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序后分析的时候就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。通过一次建库可以测得数百上千个单细胞的信息。此外，mRNA种类的含量在很大范围内变化，扩增可能会引入额外的偏差，阻碍mRNA拷贝的精确计数，因此又引入了独特分子标识符（unique molecular identifiers，UMI）随机序列，在扩增前作为独特标签标记不同的mRNA分子，允许区分原始分子和扩增重复序列。

目前针对单细胞建库测序的步骤是基本统一的。scRNA-seq实验主要涉及以下几个模块化步骤：单细胞悬浮液制备、单细胞分离和裂解、mRNA提取、mRNA逆转录（RT）到cDNA、测序文库构建，以及使用计算工具进行数据分析。

随着单细胞技术相关研究的深入，scRNA-seq的应用已从基础研究扩展到临床研究，如构建生物体基因表达图谱、重建细胞发育谱系、发现疾病生物标志物、肿瘤免疫微环境分析和临床诊断等领域。

三、单细胞测序技术的技术挑战

1）准确、快速地分离单个细胞；2）从单个细胞中扩增微量RNA；3）提高大规模并行处理的细胞吞吐量，同时降低单独文库准备和测序的预算。4）scRNA-seq方法仅限于多聚腺苷酸mRNA分析，而非多聚腺苷酸RNA物种，包括非编码RNA和RNA修饰，目前的scRNA-seq方法尚未进行探索。5）缺少实验和计算方法的质量控制和标准化的共同基准。6）空间转录组的分辨率仍未实现真正单细胞水平。

四、参考文献

1、Tang Fuchou, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6(5):377-82(2009)

2、Tang, X., Huang, Y., Lei, J. et al. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell Biosci 9, 53 (2019)

3、Li H. Single-cell RNA sequencing in Drosophila: Technologies and applications. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2021

4、Chen Y, Song J, Yang C, et al. Single-Cell Sequencing Methodologies: From Transcriptome to Multi-Dimensional Measurement. Small Methods. 2021

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